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產(chǎn)品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產(chǎn)品英文名稱：Human Haptoglobin Protein, His tag

產(chǎn)品中文名稱：重組人觸珠蛋白，His標(biāo)簽（Haptoglobin ）

規(guī)格：5 μg/20 μg/100 μg/1 mg

貨號：EY-01X8723
用途：僅供科研研究實驗

特點&優(yōu)勢:

表達(dá)宿主:大腸桿菌

種屬:人

序列:氨基酸序列來源于： 人觸珠蛋白(AAA88080.1) (Ile162-Asn406)在n端帶有6×His標(biāo)簽。

蛋白長度：重組人觸珠蛋白由245個氨基酸組成，預(yù)測分子量為27.2 kDa。

純度:> 95 % ，使用SDS-PAGE檢測

通過LAL法測定，每微克蛋白里內(nèi)毒素含量< 0.1 EU。

產(chǎn)品形式:凍干粉，凍干緩沖液為無菌的PBS, pH 7.4.

基因ID:3240

使用中注意事項:開蓋使用前，請先離心。本產(chǎn)品為凍干粉，推薦用該產(chǎn)品配套的Reconstitu動?動

背景

Haptoglobin is a glycoprotein, which is synthesized in the liver and circulates in the blood. Haptoglobin is usually produced by liver cells, but it is also produced by other tissues, such as skin, lung and kidney. It is a positive acute phase protein, which binds to free hemoglobin and removes it from circulation to prevent kidney injury and iron loss after hemolysis. Decreased levels can be seen in hemolysis and impaired liver function. A high level is a sign of acute or chronic inflammation. Hemoglobin deficiency or hypohaptoglobinemia is caused by mutation of haptoglobin gene and/or its regulatory region. Haptoglobin is also related to diabetic nephropathy, the incidence of coronary artery disease in type 1 diabetes, Crohn's disease, inflammatory disease behavior, susceptibility to primary sclerosing cholangitis, idiopathic Parkinson's disease and the reduction of the incidence of plasmodium falciparum malaria.

本產(chǎn)品具有下列特點:

 1.操作簡便、快捷?？芍苯蛹尤氲綑z測平板。在96-孔板中檢測時,無需洗滌或收獲細(xì)胞,免去溶解步驟。

2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發(fā)性的有機溶劑來溶解甲臜產(chǎn)物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數(shù)后可放回溫箱繼續(xù)孵育,使顏色進一步生成。

操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

(四)誘導(dǎo)表達(dá)

1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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